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ANALISIS RUTINARIO DEL LCR
El examen de rutina del LCR incluye el estudio de las características físicas (color, turbidez...), recuento total de células nucleadas (RTCN), recuento de eritrocitos, la determinación de la concentración de proteínas y, finalmente, el examen citológico.
EVALUACION MACROSCOPICA DEL LCR:
El LCR normal es transparente, de baja viscosidad e incoloro. Para las observaciones macroscópicas, el LCR deberá estar contenido en un recipiente limpio y transparente. Debe evaluarse en un lugar bien iluminado, comparándolo con un tubo similar con agua destilada y contrastarlo sobre un fondo blanco. Cualquier cambio en el color o turbidez de la muestra es considerado como anormal.
Color:
Rosado: Generalmente está producido por hemorragia. La hemorragia se produce en la mayoría de los casos por causas yatrogénicas durante la técnica de recolección al atravesar con la aguja algún vaso sanguíneo o seno vascular. Para distinguirlo del LCR hemorrágico, el clínico debe observar cuidadosamente la salida del LCR. En el caso de una contaminación con sangre durante la toma de muestra se observará un hilillo de sangre formando un remolino rojo rodeado por LCR claro. Los hematíes en el LCR, in vivo, son degradados rápidamente, por lo que otro modo de diferenciar la hemorragia patológica de la contaminación con sangre es centrifugar la muestra. Si el sobrenadante es claro, es contaminación, y si adquiere una coloración rosada o incluso amarillenta debemos considerar hemorragia previa a la punción. La centrifugación del LCR destruye las células, por lo que debe realizarse tras el recuento celular y sedimentación del mismo para su estudio citológico.
Xantocromía: El término xantocromía se refiere al color anaranjado pálido o amarillo del sobrenadante. La xantocromía se debe generalmente a la oxihemoglobina, metahemoglobina o bilirrubina producidas durante la degradación de los eritrocitos y el catabolismo de la hemoglobina. Es por lo tanto, un signo de hemorragia intracerebral o subaracnoidea en ausencia de hiperbilirrubinemia. Se produce varias horas tras el episodio hemorrágico. En casos raros, puede observarse xantocromía del LCR por la elevada ingesta de carótenos, y por la presencia de melanina en melanomas meníngeos.
Turbidez:
Cualquier grado de turbidez en el LCR es anormal. Una ligera opalescencia apenas perceptible por el ojo humano contiene mas de 700 hematíes/microL o 200 células nucleadas/microL. Las concentraciones normales de éstos elementos son mucho menores en el LCR, por lo que la ausencia de turbidez no debe considerarse como celularidad normal. Siempre debe realizarse el recuento celular.
Las concentraciones muy altas de proteínas en el LCR, tambíen pueden traducirse en un aumento de la turbidez. En éste caso también puede estar aumentada la viscosidad.
TECNICAS DE RECUENTO CELULAR:
El LCR normal es prácticamente acelular. Se ha establecido que el rango de referencia de las células nucleadas totales (RTCN) es de 0-5 cels/microL para el paciente canino y de 0-8 para el felino, sin embargo, en la mayoría de los estudios realizados en perro y gato, la práctica totalidad de los animales normales tiene un recuento entre 0 y 2 céls/ microL. Se ha publicado un estudio que considera que el RTCN es menor si la muestra ha sido obtenida mediante punción lumbar, que si se ha obtenido de la cisterna cerebromedular. De cualquier modo e independientemente del lugar de extracción, los valores generalmente están dentro de la normalidad, por lo que probablemente las diferencias encontradas no tengan importancia clínica.
El aumento en la concentación de células nucleadas en el LCR recibe el nombre de PLEOCITOSIS.
El recuento se realizará con una cámara hemocitométrica de Neubauer, o similar, inmediatamente a la recogida del LCR (en la primera media hora tras la extracción) para evitar la degeneración celular. Preferiblemente, utilizaremos el tubo sin anticoagulante para evitar errores por dilución de la muestra. Describiré a continuación el procedimiento a realizar con la cámara de Neubauer.
Preparamos la cámara con el cubre. Homogeneizamos la muestra invirtiendo suavemente el tubo varias veces, y con una pipeta llenamos el espacio comprendido entre la cámara y el cubre, en las dos áreas de recuento de la cámara. Dejamos reposar unos 5 minutos para que las células se asienten. Posteriormente, enfocamos el microscopio con el objetivo de 4x hasta observar la malla y vamos cambiando los objetivos a mayor aumento hasta llegar al de 40x. Se recomienda cerrar el diafragma del microscopio para obtener un mayor contraste y observar las células con mayor nitidez.
En la cámara de Neubauer, la malla está constituida por una serie de líneas que delimitan una superficie de 3 x 3 mm; es decir la superficie total es de 9 mm cuadrados. Contaremos todos los hematíes y todas las cels nucleadas por separado en los 9 cuadrados grandes que conforman la malla. El resultado lo multiplicaremos por 1,1 y obtendremos el nº de hematíes/microL y el RTCN/microL Realizaremos el mismo procedimiento en la otra área de recuento del hemocitómetro y hallaremos la media de las dos áreas de recuento. Pueden realizarse técnicas de dilución de la muestra si la concentración celular es muy elevada, aunque la mayoría de las veces no será necesario.
Los hematíes se reconocen porque son pequeños y no poseen estructura interna. A veces se los observa crenados (con pequeñas espículas que los rodean). Sin embargo, las cels nucleadas, por lo general son de mayor tamaño, observándose irregularidades en su interior que se corresponden al núcleo o a estructuras citoplasmáticas. Existen algunas técnicas de tinción que permiten diferenciar con mayor claridad los hematíes de las células nucleadas, pero no aconsejo su utilización ya que diluyen una muestra que ya de por si posee muy baja concentración de células. Puede cogerse práctica con la observación sistemática de los hematíes y leucocitos del sedimento urinario.
En muestras muy contaminadas con sangre se producirá un falso incremento de células nucleadas, ya que en una hemorragia, con los hematíes también se extravasan los leucocitos. Tendremos, por lo tanto, que introducir un factor de corrección que nos aproxime al número real de células nucleadas del LCR (si no hubiera contaminación con sangre). Se estima que la muestra aumenta en un leucocito por cada 700 hematíes, considerando que tanto la concentración de hematíes como de leucocitos en sangre periférica es normal. Se propone a continuación una fórmula de corrección para estimar el “exceso” de leucocitos:
Leucocitos adicionales = Ls x Hlcr / Hs
Donde:
Leucocitos adicionales = leucocitos sumados al LCR a partir de la punción traumática.
LS = recuento de leucocitos en sangre periférica.
HLCR = recuento de hematíes en LCR.
HS = recuento de hematíes en sangre periférica.
Lógicamente, para obtener el RTCN real del LCR debemos restar la concentración de células nucleadas obtenido mediante el recuento con la cámara hemocitométrica, menos los leucocitos adicionales estimados por la punción traumática.
RTCN real = RTCN cámara hemocitométrica – Leucocitos adicionales
Los errores en las correcciones de leucocitos aumentan a medida que aumentan las concentraciones de hematíes en el LCR, por lo que es aconsejable desechar las muestras claramente hemorrágicas (o con recuentos superiores a 100.000 hematíes/microL).
ESTUDIO CITOLOGICO:
Antiguamente, cuando se realizaba el RTCN, sólo se procedía a realizar el estudio citológico si el RTCN era superior al normal. Esta no es una buena práctica, ya que pueden presentarse alteraciones citológicas en LCR con RTCN normales.
El estudio citológico nos permite valorar los tipos celulares presentes. La preparación de la muestra se realizará en los 30 minutos tras la extracción del LCR y preferiblemente conservado con EDTA. El LCR normal es pobre en células y en numerosas patologías se producen pequeños aumentos de las mismas, por lo que es preciso concentrar las células. No se puede utilizar una centrífuga convencional, ya que sus altas revoluciones destruyen las células. Lo ideal es utilizar una citocentrífuga, que con bajas revoluciones permite concentrar y adherir directamente las células al portaobjetos. Con ésta técnica se obtiene una morfología celular excelente, sin embargo, las citocentrífugas específicas para el estudio citológicos de líquidos orgánicos son de elevado coste y prácticamente sólo están disponibles en laboratorios especializados.
Una alternativa de bajo coste, y que ofrece resultados satisfactorios, consiste en sedimentar las células por efecto de la gravedad. Esta técnica no ofrece una morfología celular tan buena como con la citocentrifugación, aunque se logra concentrar un número importante de células. Se describe a continuación el procedimento:
Se recorta un cilindro de aproximadamente 1 cm de diámetro y unos 2 cm de largo. Puede utilizarse el plástico de una jeringa de 2 ml. La porción alada de la jeringa se adhiere con vaselina al centro de un portaobjetos totalmente limpio (limpiar previamente con alcohol y un paño suave), de tal modo que se forma un recipiente cuya base está formada por el portaobjetos y las paredes por el cilindro. Finalmente, con ayuda de una pipeta se deposita en el interior al menos 0,5 ml de LCR. Lo dejamos en reposo durante 30 minutos para que se sedimenten las células y retiramos cuidadosamente con una pipeta todo el líquido sobrenadante. Retiramos el cilindro y secamos la preparación con un movimiento enérgico del porta. Es esencial realizar un secado rápido preservándolo del calor y la humedad. Una vez seco, procederemos inmediatamente a fijar la muestra y teñir.
Para la tinción citológica se utilizan varios procedimientos, aunque la más habitual en clínica es el Diff-Quick que tiene la ventaja de ser rápida y de bajo coste. Otras tinciones citológicas que pueden utilizarse son Giemsa, Wright, Gram u otras especiales, como tinción con tinta china para Criptococcus, Ziehl-Nielsen para micobacterias, etc.
Tras la tinción se explora el campo con a partir de objetivos de bajo aumento hasta llegar al objetivo de 40x. Con un buen microscopio y un poco de práctica, las células son perfectamente diferenciables con el objetivo de 40x, pero puede ser preciso utilizar el objetivo de inmersión para observar detalles o poner en evidencia elementos bacterianos u otras estructuras anormales.
Las células que pueden observarse en el LCR son:
Hematíes.
Neutrófilos.
Eosinófilos.
Mononucleares (Monocitos/macrófagos).
Linfoides (Linfocitos y células plasmáticas).
Células neoplásicas.
Cálulas procedentes de estructuras adyacentes (meningeas...)
Células epiteliales descamativas obtenidas por arrastre de la piel durante la punción.
Otros elementos que podemos encontrar son:
Protozoos.
Estructuras fúngicas.
Bacterias.
El estudio citológico debe incluir un diferencial celular, anotando el número de las células observadas. No es lo mismo interpretar un valor de 50 % de neutrófilos si se han cuantificado 4 céls/microL que si han contado 50 céls/microL.
Citología normal del LCR:
El LCR está compuesto casi exclusivamente por células mononucleares, de las cuales son los linfocitos maduros y pequeños las células predominantes. Son células redondas, y con escaso citoplasma (elevado ratio núcleo-citoplasmático). Los linfocitos reactivos son ligeramente más grandes y con mayor cantidad de citoplasma, que generalmente se encuentra más basófilo (por incremento en la síntesis proteica), pudiendo estar presentes en ocasiones en muestras normales.
El otro tipo celular predominante en el LCR normal es la célula mononuclear grande. Provienen de los monocitos sanguíneos. En ocasiones se las denomina células monocitoides. Tienen abundante citoplasma y núcleo de forma variable, pudiendo ser arriñonado o en forma de herradura. La cromatina es más laxa que la de los linfocitos. A menudo contienen vacuolas citoplasmáticas que pueden ser pequeñas o grandes, dando un aspecto espumoso. Estas células se activan en procesos inflamatorios, aumentando su tamaño. Las células monocitoides con un citoplasma muy abundante y vacuolado se denominan macrófagos. En ocasiones exhiben fenómenos de fagocitosis.
Raramente pueden observarse células que tapizan la leptomeninge, plexos coroideos o células basales ependimales. Se observan más a menudo cuando se intenta aspirar el LCR durante su extracción. Las células leptomeningeas son morfológicamente parecidas a las células mesoteliales que pueden observarse, por ejemplo, en efusiones abdominales o pleurales. Debido a su similitud, a veces se clasifican como células monocitoides. Las células de los plexos coroideos o basales ependimales son pequeñas, columnares o cuboides. Es raro observar éstos tipos celulares. Lo realmente importante es no confundirlas con células neoplásicas.
Anormalidades citológicas en el LCR:
La presencia de neutrófilos es considerado generalmente como anormal, indicando un proceso inflamatorio. Se admite como normal el recuento de hasta un 3 %, si han sido contadas más de 50 células. Debe considerarse que el número de neutrófilos puede aumentar artefactualmente en muestras contaminadas con sangre. Los neutrófilos pueden ser normales o exhibir cambios degenerativos. Los normales tienen el nucleo lobulado, con 3 a 5 lobulaciones bien diferenciadas y cromatina condensada. Los neutrófilos, al igual que los monocitos una vez que abandonan el torrente circulatorio no regresan. Es un proceso irreversible. Por lo tanto envejecen y mueren en el tejido. Los neutrófilos “viejos” que han permanecido durante largo tiempo en el LCR sin desarrollar degeneración, muestran hipersegmentación (> de 5 lobulaciones) e incluso picnosis. Estos cambios se observan con frecuencia en procesos inflamatorios asépticos (Por ej. en la meningitis supurativa que responde a corticoides).
La degeneración neutrofílica se produce como consecuencia de la lesión en las membranas celular y nuclear por la acción de endotoxinas liberadas por bacterias Gram (-) y algunas exotoxinas de bacterias G(+). Los cambios degenerativos incluyen un aumento del tamaño nuclear con pérdida parcial o total de las lobulaciones, observándose la cromatina más laxa y con pérdida de coloración. Las meningitis bacterianas son muy raras en el perro y en el gato, aunque debe sospecharse ante un patrón de neutrófilos degenerados, sobretodo si exhiben formas bacterianas fagocitadas en su citoplasma. Por último, indicar que la ausencia de degeneración no es excluyente de infección, ya que muchas bacterias patógenas no inducen cambios degenerativos.
La presencia de macrófagos es tambien considerado como anormal, sobretodo si contienen abundante citoplasma muy vacuolado (espumosos) o si muestran fenómenos de fagocitosis. La eritrofagocitosis es indicativa de hemorragia patológica. La leucofagocitosis se observa generalmente ante una inflamación neutrofílica (Los neutrófilos han envejecido y son “barridos” por los macrófagos). En ocasiones, las células fagocitadas se degradan y aparecen como inclusiones redondas que deben diferenciarse de estructuras fúngicas.
Las células plasmáticas son de origen linfoide. No se observan en el LCR normal y su presencia es indicativa de una respuesta humoral a un antígeno local. Tienen el núcleo excéntrico con la cromatina condensada. Su citoplasma es muy basófilo, presentando una región clara perinuclear correspondiente a un aparato de Golgi muy desarrollado.
Los eosinófilos son anormales en el LCR. Pueden estar presentes en cualquier proceso inflamatorio, aunque si están muy elevados debe considerarse un proceso parasitario del SNC, o una reacción de hipersensibilidad.
La observación de células neoplásicas es muy rara en el LCR, a excepción del linfoma con afectación del SNC. Las células neoplásicas en éste caso son de naturaleza linfoblástica. Son células linfoides, generalmente de mayor tamaño que los linfocitos maduros normales (pueden tener más del doble del diámetro nuclear). El citoplasma es muy basófilo y a menudo se observan nucleolos, que pueden ser aberrantes, de gran tamaño, con formas irregulares y excéntricos. Pueden llegar a observarse algunas figuras mitóticas. Han sido descrito casos de neoplasias exfoliativas al LCR con morfología celular muy similar a linfoblastos (o linfocitos malignos), pero que al realizar estudios con marcadores celulares por citometría de flujo han sido diagnosticados como células procedentes de meduloblastomas.
En algunas pocas ocasiones puede evidenciarse el agente infeccioso obteniéndose, de éste modo, un diagnóstico definitivo. Como ya ha sido comentado, es muy raro observar bacterias en el LCR, pero su presencia es diagnóstica de un proceso séptico bacteriano. Es preciso verlas fagocitadas por las células inflamatorias, ya que si se hallan en el fondo del frotis puede deberse a contaminación durante el proceso de preparación y tinción de la muestra.
Las levaduras fúngicas pueden ser perfectamente identificables en el LCR, utilizando tinciones convencionales, por ejemplo en micosis sistémicas causadas por Histoplasma capsulatum o Blastomyces spp. Se considera que en más del 60 % de las meningitis criptocócica es identificable el organismo durante el examen citológico del LCR.
Otros organismos que pueden llegar a identificarse son mórulas de Ehrlichia, tanto su forma granulocítica (E. ewingii), como monocítica (E. canis). Según algunos autores, el reconocimiento de las mórulas en el LCR es bajo en animales con afectación neurológica por Ehrlichiosis.
La punción en hueso durante la recolección puede producir contaminación del LCR con elementos de la médula ósea. La presencia de megacariocitos u otras células hematopoyéticas inmaduras (normoblastos) facilitan el diagnóstico.
A veces, se observan elementos artefactuales como el polvo que recubre los guantes de látex. Son estructuras de morfología esférica o hexagonal, con los cantos romos y poseen unas fisuras centrales curvadas.
CONCENTRACION DE PROTEINAS:
Las concentraciones de proteínas en el LCR son muy bajas en comparación con otros líquidos orgánicos, por lo que no pueden utilizarse técnicas convencionales, como el método de Biuret, que es adecuada para la medición de proteínas plasmáticas, pero de baja sensibilidad para el LCR. El valor de referencia normal para el perro y el gato es < de 30 mg/dL si el LCR ha sido obtenido de la cisterna cerebromedular y < de 40 mg/dL del obtenido mediante punción lumbar. La hiperproteinorraquia es el aumento de proteínas en el LCR, pudiendo procesder de dos fuentes: una, a partir de la sangre como consecuencia de una lesión de la barrera hematoencefálica, o puede proceder de una síntesis local de inmunoglobulinas.
La determinación de la concentración de proteínas totales, puede realizarse con el tubo con EDTA, o con el que no contiene anticoagulante; sin embargo se recomienda realizarlo con el que no lleva anticoagulante para evitar leves falsos aumentos por efecto del EDTA. Las proteínas, a diferencia de los elementos formes, son bastante estables en el LCR, por lo que puede enviarse a un laboratorio externo para su determinación sin necesidad de emplear métodos de conservación especiales.
Para la determinación cuantitativa de proteínas del LCR no pueden utilizarse las técnicas convencionales empleadas para las muestras de sangre. Los laboratorios clínicos utilizan técnicas modificadas de la reacción de Biuret, u otras como el método turbidimétrico de Meulemans. Estas técnicas, generalmente, no se encuentran disponibles en las clínicas veterinarias, siendo necesario remitir las muestras a un laboratorio especializado para su cuantificación.
Una alternativa, que es utilizada por muchos clínicos, consiste en la utilización de la placa de bioquímica UPRO, comercializada por IDEXX, para la determinación del ratio proteina/creatinina urinaria. Según mi experiencia, ofrece una cuantificación aceptable, aunque desconozco si el método está validado para la determinación de proteínas en el LCR.
Asimismo, puede estimarse de forma semicuantitativa mediante la utilización de una tira urinaria. Este método es mas sensible para la albúmina que para las globulinas ofrecendo lecturas de: negativo, trazas, 1+ (30 mg/dL), 2+ (100 mg/dL), 3+ (300 mg/dL) y 4+ (> 2000 mg/dL). El problema que plantea es que aumentos leves de proteína (alrededor de 50 mg/dL), pueden interpretarse como valores dentro de lo normal (Valores < de 30 mg/dL). Esta técnica, sin embargo es confiable para el diagnóstico de hiperproteinorraquia cuando se observan valores superiores a 100 mg/dL.
Se producirá un valor falsamente elevado de proteínas en aquellas muestras contaminadas con sangre, ya que el plasma sanguíneo posee una concentración protéica mucho más elevada. Al igual que lo expuesto en el apartado de recuento de celulas totales nucleadas, deberá efectuarse una corrección.
Proteinas adicionales = Ps x Hlcr /Hs
Donde:
Proteínas adicionales = concentración de proteínas sumados al LCR a partir de la punción traumática.
PS = recuento de proteinas en sangre periférica.
HLCR = recuento de hematíes en LCR.
HS = recuento de hematíes en sangre periférica.
Del mismo modo que en el cálculo de celulas núcleadas, debemos restar las proteínas obtenidas menos las proteínas adicionales estimadas por la hemorragia. Tampoco debería realizarse la corrección si la contaminación con sangre es muy elevada.
Proteínas totales reales = Proteínas obtenidas – Proteínas adicionales (por hemorragia)
Los errores en la cuantificación de proteínas pueden aumentar proporcionalmente a la hemorragia en el LCR.
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